Доктор: иРНК терапия за JEB

През първата година на този докторски проект са подготвени „тестови“ наночастици, които са приложени към човешки кожни клетки, за да се определи най-ефективната смес от протеинов наногел и иРНК, както и колко дълго клетките трябва да бъдат изложени на това, за да се получат най-добри резултати. иРНК последователностите, кодиращи протеините LAMB3 и COL17A1, са подготвени в наночастици, използвайки резултатите от първоначалните тестове.

Ръководител на изследването:

Професор Хелън Маккарти заема катедрата по наномедицина и ръководи изследователската тема „Наномедицина и биотерапия“ в Факултета по фармация. Тя също е асоцииран заместник-канцлер в Queen's University Belfast (QUB). Нейните изследвания са съсредоточени върху нови невирусни системи за доставяне на нуклеинови киселини и анионни малки молекули.

Съкандидат:

Професор Никълъс Дън е катедра по инженерство на биоматериали в Училището по машинно и производствено инженерство в градския университет в Дъблин (DCU). Неговата лаборатория се фокусира върху дизайна, характеризирането, производството и оценката на комбинации лекарство-биоматериал за мускулно-скелетно възстановяване/регенерация, заздравяване на рани и режими на рак.

„Тази докторска степен има за цел да създаде успокояващ гел, който е пълен с наночастици, за да достави генетичния товар вътре в клетките.“

Заглавие: Разработване на двоен наногел за Junctional Epidermolysis Bullosa

Има два основни типа Булозна епидермолиза на свързване (JEB), или „генерализирана тежка“ с продължителност на живота от 1-2 години, или „генерализирана междинна“ с нормална продължителност на живота. Има два преобладаващи гена, които са дефектни (LAMB3 и COL17A1) и които трябва да бъдат поправени за ефективно лечение.

Юнкционната булозна епидермолиза (JEB) е инвалидизиращо заболяване, при което слабата граница между дермата и епидермиса прави кожата склонна към разслояване и образуване на мехури. JEB представлява 5% от общия брой случаи на EB, а дефицитите в гените LAMB3 и COL17A1 присъстват съответно в 70% и 100% от случаите на JEB. Генът LAMB3 носи информацията за част от протеина ламинин, който позволява на клетките да се прикрепят, докато COL17A1 кодира алфа веригата на колаген тип XVII, която има критична роля в епидермалната адхезия. Понастоящем генетичната терапия има най-голям потенциал за лечение на това заболяване, но генетичният товар трябва да бъде доставен вътре в клетките, тъй като там могат да се произвеждат функционалните протеини.

Тази докторска дисертация има за цел да създаде успокояващ гел, зареден с наночастици, които да доставят генетичния товар вътре в клетките. Тази технология се състои от три части: (i) два вида иРНК, които ще повишат експресията на LAMB3 и COL17A1; ii) пептид, съставен от естествени аминокиселини, който ще кондензира генетичния товар в наночастици, за да достави иРНК товара вътре в клетките; iii) наногел, който ще съдържа наночастиците. Наногелът е биоразградим във вода и биосъвместим „интелигентен“ материал, чувствителен към промените в средата на раната. Целта е да се създадат данни за този гел, така че след докторантурата да може да започне комерсиализацията му с цел пациентите в крайна сметка да могат сами да прилагат гела като локално лечение.

Проф. Маккарти и проф. Дън имат над 20 години опит в производството на „умни“ материали с опит в комерсиализацията. Патентованият доставящ пептид, наречен (CHAT), може да се използва за кондензиране на иРНК, която кодира експресията на LAMB3 и COL171A1, в малки наночастици, които навлизат в клетките, без да причиняват възпалителен отговор. Това е така, защото CHAT пептидът е съставен от естествени аминокиселини, които влизат в клетките и действат като троянски кон за генетичен материал. Тези наночастици ще бъдат поставени в гел, който може да се разнесе върху кожата от пациента или болногледача, а пептидът ще достави генетичната терапия вътре в клетките. Маккарти и Дън планират да приложат уменията си като нови изследователи в EB.

Този проект обаче е значително намален, тъй като имаме опит в формулирането на гел, доставката на гени и разработването на продукти, като всички те ще доведат до клинична прогресия. Изключително важно е да се отбележи, че този проект няма да бъде предприет изолирано, тъй като пациенти с ЕБ, членове на семейството, болногледачи в общността и клиницисти ще бъдат ключови заинтересовани страни, които ще ни помогнат да разберем какво работи за тях по отношение на продукта и какви са техните нужди. Следователно планираната програма за PPI е от основно значение, за да се гарантира, че участието на обществеността и пациентите е наистина вградено в проекта.

Обществено участие на пациента:

Пациентите с БЕ, членовете на семействата им и групите, полагащи грижи в общността, ще играят три основни роли в разработването на наногеловия продукт: първо, идентифициране на целеви профил на продукта (TPP), който ще осигури на пациентите с БЕ най-голямо подобрение в качеството на живот; второ, подпомагане на проектирането и приложението на продукта, например опаковането и доставката, така че да се позволи актуализирането на TPP на пациентите; и трето, подготовка на подходящи крайни точки за бъдещи изпитвания на наногела. Като такъв, този ангажимент на PPI ще се стреми да работи с пациенти с БЕ, техните семейства и общността, полагаща грижи, и това ще бъде улеснено чрез официално заявление до DEBRA UK.

Групата PPI от пациенти с БЕ, членове на семействата им и общността, полагащи грижи, ще участва в 3-4 сесии, по време на които ще могат да видят и боравят с формулировките на наногелове чрез различни апликатори за доставяне, както и с потенциални комбинации от настоящите системи за опаковане. Тези напълно характеризирани наногелове ще бъдат заредени в редица налични в търговската мрежа и стерилизируеми апликатори с ръчна помпа. Участниците ще споделят информация за лекотата на използване на различните комбинации от помпи и материали и тази информация ще бъде използвана за избор на наногел с оптимални физични свойства, доставян чрез най-лесния за използване апликатор с ръчна помпа. Тези сесии ще бъдат от решаващо значение за определяне не само на аспектите на настоящите интервенции, които най-много влияят на качеството на живот на пациентите с БЕ, но и за получаване на обратна връзка по отношение на лекотата на приложение и възприятието за употреба на наногеловия материал. PPI резултат: Целеви продуктов профил и дизайн на апликатора/опаковката, които да позволят на пациентите с БЕ да прилагат свой собствен наногел.

Този докторски проект, озаглавен „Разработване на двоен наногел за булозна епидермолиза на юнкционен участък“, има за цел да създаде локална генна терапия, която може да доставя работещи копия на LAMB3 и COL17A1 до засегнатите кожни клетки. Подходът използва информационна РНК (иРНК), за да инструктира клетките да произвеждат липсващите протеини, опаковани в двойна наногелна система, проектирана за безопасно и ефикасно доставяне в кожните клетки.

Досегашната работа е установила основните методи, необходими за производството и тестването на тези наночастици. В лабораторията е произведена иРНК на зелен флуоресцентен протеин (GFP) и е комбинирана с HAWC пептид, състоящ се от естествени аминокиселини, за да се образуват наночастици. Целта на това е да се определи идеалното съотношение на пептид към иРНК, необходимо за навлизане в кожните клетки. Използвайки систематичен дизайн на експерименти, екипът оптимизира ключови променливи - като съотношението на наногел към иРНК, количеството на приложената иРНК, колко клетки са били посяти и колко дълго са били изложени клетките - за да се максимизира усвояването и производството на протеини в човешки кератиноцитни клетъчни линии (HaCaT). Получените наночастици са измерени по размер на частиците, повърхностен заряд, еднородност и как ефектите им се променят с дозата, потвърждавайки, че процесът е възпроизводим и подходящ за мащабиране до терапевтични иРНК.

Въз основа на това, mRNA последователности за LAMB3 и COL17A1 са проектирани и оптимизирани с помощта на биоинформатични инструменти. Тези терапевтични mRNA са формулирани с помощта на HAWC пептид в наночастици, използвайки условията, определени от предишни GFP данни. Формулировките са характеризирани по подобен начин, както по-горе.

Успоредно с това, изходните нива на LAMB3 и COL17A1 бяха измерени в HaCaT кератиноцити, използвайки полимеразна верижна реакция в реално време (RT-qPCR) с три статистически повторения. Допълнително беше наблюдавана повишена регулация както на LAMB3, така и на COL17A1 чрез включването на наночастици върху HaCaT кератиноцити. Тези данни ще насочат проектирането на модели на нокдаун, които имитират JEB. Безопасността ще бъде оценена чрез тестове за клетъчна жизнеспособност, за да се определи дали наночастиците са ефективни, без да причиняват увреждане на мембраната или клетъчна смърт. Където е възможно, генетично редактирани HaCaT клетки, лишени от LAMB3 или COL17A1, ще бъдат използвани, за да се тества дали лечението възстановява протеиновата функция и подобрява клетъчната адхезия.

Фокусът през следващата година ще бъде върху проектирането, производството и оптимизирането на полимерен наногел за локално доставяне на LAMB3- и COL17A1-mRNA/HAWC наночастици и за осигуряване на антимикробна защита на мястото на раната. Ще бъдат избрани полимери с медицинско качество, за да се получи биоразградим, биосъвместим наногел, като например материали, наречени смес от поливинилов алкохол и полиетилен гликол (PVA-PEG), с регулируемо разграждане и подходящо реологично поведение за приложение върху кожата. Ще бъде използван подход „Дизайн на експерименти“ за оптимизиране на ключови параметри на формулировката, например молекулно тегло на полимера и съотношения на компонентите, за да се постигне подходяща плътност на омрежване, механична стабилност и лекота на приложение.

Тази работа полага основите за локална наногелна терапия с двоен ген, която в бъдеще би могла да укрепи кожата при хора с JEB и да намали образуването на мехури. Фигурата по-долу очертава цялостния работен процес, разделящ и трите работни пакета със специфични подзадачи за всеки от тях.

(От доклада за напредъка за 2026 г.)