Генна терапия за EBS и RDEB (2022)

Въпреки трудностите при получаване на кожни проби по време на периода на ограниченията на Covid, изследователите показаха, че лечението им може да позволи генетичната промяна, която причинява пропускане на RDEB („прескачане на екзон“) в кожата, както и в клетките в съда. Инжектирането на лечението в кожни проби, останали от хирургични процедури, доведе до ниско, но откриваемо ниво на пропускане на екзони в стъпката преди производството на колагеновия протеин. Изследователите предполагат, че ще е необходима допълнителна работа, за да се покаже дали това позволява да се направи достатъчно работещ колагенов протеин за намаляване на симптомите на RDEB.

Използването на малки части от нуклеинова киселина (като ДНК) за подпомагане на производството на работещ колаген и кератинов протеин от счупени RDEB или EBS гени показа известно обещание в клетките. Беше по-трудно да се покажат ефектите върху кожата, където тези малки парчета терапевтична нуклеинова киселина изглежда действат по различен начин. Изследователите публикуваха a Рецензия от напредъка в тази област през 2021 г. 

Този проект се основава на работата на изследователите, публикувана през 2019 г.:

• Естественото пропускане на екзон поставя началото на пропускането на екзон като терапия за дистрофична булозна епидермолиза: Молекулярна терапия – Нуклеинови киселини (cell.com)
• Терапии за булозна епидермолиза: доставката е ключова – Bremer – 2019 – British Journal of Dermatology – Wiley Online Library

Университет Дънди съобщи по проекта през 2019 г.

Водещи изследователи:

Д-р Робин Хикерсън е главен изследовател в Училището по науки за живота с активна изследователска група с основен фокус върху разработването на терапевтични средства за редки генетични кожни заболявания.
Д-р Петер ван ден Акер, сътрудник по клинични изследвания на DEBRA, е опитен клиничен генетик и е фокусирал изследователската си кариера върху базирани на РНК терапии за RDEB и други генодерматози.

Съизследовател:

Д-р Айлийн Сандиландс има богат опит от 19 години в групата в генетични кожни заболявания и разработване на системи за пропускане на екзони с цел лечение на генетични кожни заболявания

„Крайната ни цел е да разработим терапевтични средства за всички форми на EB… Въз основа на вълнуващите и окуражаващи резултати от предишната ни работа, сега планираме да оптимизираме ефективността на пропускане на екзони в нашите ex vivo и in vivo модели на човешка кожа, за да ни доближим към клинично изпитване“

Д-р Робин Хикерсън и д-р Питър Ван ден Акер

Заглавие на безвъзмездната помощ: Разработване на нова генна технология за лечение на булозна епидермолиза симплекс (EBS) и рецесивна дистрофична булозна епидермолиза (RDEB)

Около 70% от случаите на булозна епидермолиза (EB) се класифицират като EB симплекс (EBS), което се причинява от мутации (грешки) в гените, които произвеждат протеини, наречени кератин 5 и кератин 14 (KRT5 и KRT14). Кератините са жизненоважни за осигуряване на силна и здрава кожа. Няма ефективни лечения за EBS, който се характеризира с упорити мехури и лошо зарастване на кожата както вътрешно, така и външно. Гените се наследяват, по едно копие от всеки родител. Само едно копие на гена трябва да съдържа мутация, за да причини EBS – те се наричат ​​доминантни гени. Чрез селективно потискане на експресията на дефектното копие на гена, това позволява на нормалното копие на гена да работи правилно, стратегия, за която се смята, че може да се развие в подходяща терапия за EBS.
Първоначалната цел на този проект беше да се разработи нова технология за терапевтично заглушаване на гени в EBS. Когато генетичната или ДНК последователност на ген се чете, подобно на рецепта, тя в крайна сметка се превежда през междинен етап (информационна РНК) в производството на протеин – в този случай кератините, открити в горния слой на кожата, епидермис. Новите разработки в генната технология означават, че вече е възможно да се синтезира малка част от нуклеинова киселина, която да се свърже с информационната РНК и да я инактивира. Това се нарича технология за заглушаване на гени. Антисенс олигонуклеотидите (ASOs) са малки части от нуклеинова киселина, които могат да бъдат проектирани да се свързват специфично с информационна РНК копия на определен ген, за да ги унищожат.

Сътрудникът по клинични изследвания беше натоварен със задачата да разработи тази нова технология за заглушаване на гени до степен, в която да може да бъде приложена в клиниката. Екипът в Дънди работи с фармацевтичната компания WAVE Науки за живота по този проект и са идентифицирали няколко ASO, които могат да заглушат информационната РНК KRT14 в клетките на човешката кожа, отгледани в лабораторията.

Използването на ASO за рецесивна дистрофична булозна епидермолиза (по-тежка форма на ЕБ) е еднакво предизвикателство. Рецесивната дистрофична булозна епидермолиза (RDEB) се причинява от грешки в гена COL7A1, генетичната рецепта за протеиновия колаген тип 7. Всеки носи две копия на COL7A1, но за разлика от EBS, трябва да има мутация и в двете копия на ген за проявяване на симптомите на RDEB – това са рецесивни гени. Подходът за унищожаване на дефектната информационна РНК няма да работи тук. Могат обаче да се използват различни класове ASO, които могат да подмамят клетките да премахнат частта от информационната РНК, където се намира мутацията. Този подход се нарича „прескачане на екзон“ и въпреки че това ще доведе до малко по-къса информационна РНК, тя все още може да се използва за производство на активен (но по-къс) колаген тип 7. В литературно проучване сътрудникът установи, че хората, при които пропускането на екзона се случва естествено (без използването на ASO, а по-скоро поради допълнителна вариация на ДНК), все още имат форма на DEB, но това е по-леко от обикновено. Това подчертава, че пропускането на екзон е обещаваща терапевтична стратегия. Екипът в Дънди е проектирал няколко ASOs, които могат да предизвикат пропускане на екзон на COL7A1 в човешки кожни клетки, отгледани в лабораторията.

Нова антисенс технология за EB – оптимизиране на пропускането на екзони в човешката кожа (Стипендия за клинични изследвания Година 5).

Пациентите с генетично кожно заболяване рецесивна дистрофична булозна епидермолиза (RDEB) страдат от изключително крехка кожа, тъй като липсва ключов протеин (колаген 7), който държи слоевете на кожата заедно. При пациенти с RDEB, правописни грешки („мутации“) в гена, който кодира протеина колаген 7, пречат на тялото да го направи. В Университета на Дънди ние се опитваме да заобиколим правописните грешки в гена за колаген 7, като се насочваме към стъпката, която се случва преди производството на протеина. Преди да бъде направен протеинът колаген 7, генът първо прави преносимо копие на себе си, това копие се нарича информационна РНК и се използва като шаблон за създаване на протеина. При пациенти с RDEB копието на информационната РНК съдържа същите правописни грешки като гена за колаген 7. Нашата стратегия е да премахнем малка част от информационната РНК, която съдържа правописните грешки. Този подход се нарича "прескачане на екзон". Въпреки че информационната РНК ще бъде малко по-къса от нормалното, тя все още може да се използва за производството на протеин колаген 7. Разбира се, този протеин също ще бъде малко по-къс от нормалното, но това все още е по-добре, отколкото изобщо да нямате протеин колаген 7.
Прескачането на екзон използва малки молекули, наречени антисенс олигонуклеотиди (ASO), които се придържат към информационното РНК копие на гена на колаген 7 и подмамват клетките да премахнат частта, където се намират правописните грешки. Проектирахме няколко ASOs и показахме, че те са активни при пропускане на екзон, когато се добавят към човешки кожни клетки, отгледани в лаборатория. Успяхме също така да демонстрираме, че ASO са активни в истинска човешка кожа (кожа от хирургични отпадъци). Въпреки това количеството пропускане на екзони, което можем да открием в кожата, е ниско и ASO изглежда действат малко по-различно в кожата в сравнение с клетките, отгледани в лабораторията.
През последната година оптимизирахме метод, който ни позволява да проследим начина, по който ASO се разпределя, когато се инжектира в човешката кожа. Този метод ни научи, че ASO, който е инжектиран в човешката кожа, наистина пътува от дермата (дълбокия слой на кожата, където е инжектиран ASO), до клетките в епидермиса (горния слой на кожата), където прескачането на екзона трябва да се проведе. Този резултат ни убеди допълнително, че лечението с ASO наистина може да предизвика пропускане на екзон в истинска човешка кожа. Отново, това беше окуражаващ резултат. Въпреки това количеството пропускане на екзони, което открихме в кожата, беше ниско и ASO изглежда действат малко по-различно в кожата в сравнение с клетките, отгледани в лабораторията. Ето защо сега сме фокусирани върху това да направим пропускането на екзони в кожата по-ефективно.
Миналата година също проектирахме и тествахме 37 нови ASO срещу екзон 13 в клетките на кожата, за да видим дали можем да идентифицираме ASO, който работи дори по-добре от тези, които използваме в момента. Също така сме проектирали 33 нови ASO срещу екзон 15 за тестване по същия начин. Предварителните резултати идентифицираха няколко ASOs, които показват активност на пропускане на екзон 13 и затова те ще бъдат изследвани допълнително. (От доклада за напредъка за 2022 г.)

Нова антисенс технология за EB – усъвършенстване на пропускането на екзони в човешката кожа (Години 3-4).

Основната цел сега е да се проучи дали функционалните ASO могат да индуцират прескачане на екзон на гена COL7A1 и заглушаване на мутантното KRT14 РНК копие, когато се прилага върху човешка кожа (използвайки остатъчна кожа от хирургични процедури). Това включва изучаване на начини за доставяне на тези ASO на правилното място в кожата. Затова стипендиантът работи в тясно сътрудничество с екипа на д-р Хикерсън.
Основните цели на напредването на стипендията за клинични изследвания са:
• Индуцирайте „нокдаун“ на мутантната KRT14 иРНК за лечение на EBS (за да работите върху елиминирането на кератиновата информационна РНК, която носи мутацията).
• Пропуснете екзони, които съдържат мутации в гена COL7A1, за да лекувате RDEB (за да подмамите клетките на тялото да премахнат или да не разчетат частта от гена, където се намира мутацията).

Пациентите с генетично кожно заболяване рецесивна дистрофична булозна епидермолиза (RDEB) страдат от изключително крехка кожа, тъй като липсва ключов протеин (колаген 7), който държи слоевете на кожата заедно. При пациенти с RDEB, правописни грешки („мутации“) в гена, който кодира протеина колаген 7, пречат на тялото да го направи.

По време на този проект ние се опитвахме да подмамим клетките да заобиколят правописните грешки в гена за колаген 7. За да направим това, ние се насочихме към важна стъпка, която се случва преди производството на протеин. Един ген трябва първо да направи преносимо копие на себе си, това копие се нарича информационна РНК и се използва от клетките като шаблон за производството на протеина. При пациенти с RDEB копието на информационната РНК съдържа същите правописни грешки като гена за колаген 7. Нашата стратегия е да редактираме малката част от информационната РНК, която съдържа правописната грешка. Ние наричаме този подход „прескачане на екзон“. Чрез редактиране на информационната РНК по този начин и премахване на правописната грешка, клетките вече могат да произвеждат протеина колаген 7. Разбира се, този протеин ще бъде малко по-къс от нормалното, но това все още е по-добре, отколкото изобщо да нямате колаген 7 протеин.

Прескачането на екзон използва малки молекули, наречени антисенс олигонуклеотиди (ASO), които се придържат към информационното РНК копие на гена на колаген 7 и подмамват клетките да премахнат частта, съдържаща правописната грешка. Проектирахме няколко ASO и показахме, че те могат да причинят пропускане на екзон, когато третираме човешки кожни клетки, отгледани в лаборатория. Ние също се опитахме да лекуваме кожни клетки от пациент с RDEB с нашите ASO и те изглежда работят по същия начин. Можем също така да открием протеин колаген 7 в тези клетки след третиране с ASO, което ни казва, че ASO работят по предназначение.

Значителна част от проекта е изразходвана за установяване дали ASO действат върху човешката кожа. Крайната ни цел е да използваме ASO за лечение на пациенти, така че е важно да знаем дали те са активни в кожата, а не само в клетките в съда. Преди да можем да започнем тази работа, трябваше да разработим високочувствителни методи за откриване, за да уловим пропускането на екзони, тъй като тези инструменти за изследване не съществуваха в търговската мрежа. За експериментите с кожата ние инжектирахме ASO в здрава кожа, остатъчна от хирургични процедури, и след това анализирахме кожата за пропускане на екзони. Открихме, че ASO могат да причинят пропускане на екзони в човешката кожа, което разбира се е изключително окуражаващ резултат. Въпреки това, основното предизвикателство, пред което сме изправени, е, че количеството пропускане на екзони, което можем да открием в кожата, е ниско. ASO също така изглежда действат малко по-различно в кожата в сравнение с клетките, отгледани в лабораторията. Вярно е, че не знаем дали нивото на пропускане на екзони, което виждаме в кожата, е достатъчно, за да бъде от полза за пациентите (само едно клинично изпитване би предоставило окончателен отговор), но смятаме, че все още има място за подобрение. Ето защо в последната част на проекта ние се концентрирахме върху начините за увеличаване на количеството пропускане на екзони в кожата. Създадохме нов набор от ASO, за да се опитаме да идентифицираме такъв, който работи дори по-добре от тези, които използваме в момента, и също се опитахме да смесим ASO с реагент, предназначен да улесни усвояването на ASO в клетките, след като бъдат инжектирани в кожата.

Като цяло, този проект показа, че използването на ASOs за предизвикване на прескачане на екзон в истинска човешка кожа е действително възможно. Оптимизирането на ASO и подобренията в начина, по който те се доставят в кожата, ще бъдат необходими, за да се подсилят техните ефекти. Ако тези препятствия могат да бъдат преодолени, тогава прескачането на екзон като лечение за RDEB остава жизнеспособна опция. (От окончателния доклад за 2022 г.)