CRISPR/Cas9 за възстановяване на RDEB ген

По средата на проекта изследователите съобщават, че успешно са достигнали половината от своите етапи. Техните генетични „кръпки“ работят по-ефективно от очакваното, но са по-малки. Това означава, че ще имат нужда от повече от тях и ще се съсредоточат върху това през втората половина на проекта.

Водещ изследовател: Д-р Sergio López-Manzaneda е изследовател в CIEMAT със сериозен опит в редактирането на генома.

Съизследователи: Д-р Фернандо Ларчер е доцент по биохимия в Universidad Carlos III de Madrid и ръководител на отдела в CIEMAT (отдел по епителна биомедицина).

Алекс Басонс Баскуняна е докторант в групата по епителна биомедицина на отдела за биомедицински иновации в CIEMAT.

Сътрудничество: Д-р Паула Рио е международно признат експерт в генното редактиране и генната терапия на наследствени хематопоетични заболявания, от фундаменталната наука до клиничните изпитвания.

„Този ​​невирусен подход за редактиране на гени търси евтина и универсална стратегия за генериране на библиотека от инструменти, способни да се справят с всяка известна мутация... В бъдещи предклинични проучвания ще се използват генно „залепени“ редактирани кератиноцити и фибробласти от пациенти за генериране на биоинженерни еквиваленти на кожата.“

– д-р Серхио Лопес-Мансанеда

Заглавие на безвъзмездната помощ: Кръпка за редактиране на невирусен геном на COL7A1.

В този проект ние предлагаме стратегия за редактиране на генома, фокусирана върху лечението не само на една точкова мутация, а на групи от съседни мутации, причиняващи RDEB, чрез поправяне на пълни екзони, които ги съдържат. Това „генетично коригиране“ се основава на естествения механизъм за възстановяване на ДНК с хомоложна рекомбинация (HR), улеснен от системата CRISPR/Cas9. „Кръпките“ представляват малки (300-400 базови двойки) двойноверижни HDR донорни ДНК шаблони, които биха били проектирани от достатъчно генни последователности, за да покрият няколко съседни екзона, в този случай съответстващи на гена COL7A1, кодиращ колаген тип VII. Нашата цел е да характеризираме (ефикасност, безопасност) и да стандартизираме използването на тези технологии с идеята да имаме лесно достъпни специфични пластири за справяне с отделни групи мутации. Невирусната технология, предложена за ex vivo RDEB клетъчно лечение на пациенти, ще улесни нейния превод в клиниката на ниска цена.

Един от най-обещаващите терапевтични подходи за ЕБ е редактирането на генома с помощта на технологиите CRISPR/Cas9. През последните 7 години нашата лаборатория работи активно в тази област, като предоставя силни данни за доказателство за концепцията, целящи да пренесат резултатите си в клиниката. Докато сме на ръба на клинично приложение с един от тези подходи, който получи обозначението за лекарство сирак от Европейската агенция по лекарствата (EU/3/20/2253), ние продължаваме да търсим по-ефективни, по-безопасни и клинично значими стратегии за редактиране на генома.

В този проект ние предлагаме да се тества иновативен подход за редактиране на гени, който не изисква използването на вирусни вектори (целият материал се въвежда чрез една електропорация). Целта е да се използват тези „генетични пластири“ за коригиране на мутирали региони, след като е бил изрязан този генетичен регион с технологията CRISPR/Cas9. Ние сме проектирали четири различни „кръпки“, което означава шаблони за донор на dsDNA, специално модифицирани в техните краища чрез собствена технология на нашия доставчик (интегрирани ДНК технологии, IDT), за да благоприятстват HDR. Тези шаблони съдържат два екзона и тяхното обкръжение (73 и 80, по две „кръпки“) и четири различни точки на изрязване (две за екзон 73 и две за екзон 80). Тези шаблони (около 300-400 bp) също покриват съседните екзони.

Ние се стремим да оценим степента на ремонта в рамките на „кръпките“, което би ни позволило да адресираме групи от мутации или, ако системата работи достатъчно добре, да коригираме напълно екзоните в „кръпките“. Вярваме, че тази нова, невирусна, персонализирана стратегия за редактиране на гени може лесно да бъде преведена в клиниката със значително ниска икономическа цена.

Успешно достигнахме половината от етапите на безвъзмездната помощ. Първоначално нашата стратегия имаше за цел да пренапише генома с помощта на ДНК „лепенки“, за да покрие двойки екзони (по-конкретно насочени към мутации в двойки екзони: 72-73, 73-74, 79-80 и 80-81). Използваните от нас ДНК пластири обаче се оказаха малко по-различни от това, което очаквахме. Тези пластири могат да пренапишат генома с над 80% ефективност, което е по-високо от докладваното по-рано, но действието им е ограничено до тесен прозорец. Като се има предвид това, нашата стратегия за фаза 2 сега ще се фокусира върху отделни ДНК петна за всеки екзон. За да сме сигурни, че няма да модифицираме здрави ДНК последователности, CRISPR/Cas9 „молекулярното изрязване“ ще е насочено само към мутирали последователности. Това ще изисква специфични малки РНК за всяка мутация, докато общ ДНК пластир може да се използва за всеки екзон. (От доклад от юли 2024 г.).